核苷类似物环西多福韦的抗非洲猪瘟病毒活性研究

关键点

在无细胞毒性的浓度下，环西多福韦在巨噬细胞中对非洲猪瘟病毒的多种基因型表现出抗病毒活性。

在感染前或感染早期添加环西多福韦，可以抑制非洲猪瘟的复制，但在感染后期添加，没有效果。

仔猪攻毒后，环西多福韦可以延迟临床症状出现的时间，并降低病毒滴度。

这是第一次关于非洲猪瘟病毒复制抑制剂体内试验的报道。

摘要

非洲猪瘟病毒 (ASFV),非洲猪瘟病毒科的唯一成员，是具有囊膜的双链DNA病毒，基因组长度为170-193Kb，包括170-190个开放阅读框，由其引起的非洲猪瘟（ASF）是一种急性、热性、广泛出血性的传染性疾病，对家猪及野猪的致死率可达100%。目前还没有可用疫苗，其防控主要依赖于早期监测、及时扑杀感染猪群，以及遵守严格的生物安全措施。

本实验，对小分子核苷类似物环西多福韦抑制非洲猪瘟病毒复制的能力进行了研究。对干预时间的研究发现，在感染前或感染早期，添加环西多福韦可以有效地抑制非洲猪瘟的复制以及随后的基因表达。但在感染后期添加，没有效果。这说明，环西多福韦的作用靶点可能是病毒的DNA聚合酶，或者参与后期转录的RNA聚合酶。口服环西多福韦，可以延迟临床症状的出现，并且显著降低了血液及组织中的病毒滴度。上述结果说明，环西多福韦cHPMPC是一种可期待的化合物，可进一步开发以控制ASFV暴发。

非洲猪瘟第一次被报道，是在1921年的肯尼亚，之后一直在撒哈拉非洲以南的国家呈地方性流行。非洲猪瘟在1957-1921年第一次传出非洲，蔓延至葡萄牙，然后扩散至整个伊比利亚半岛。在20世纪60年代和70年代，非洲猪瘟在其他欧洲国家都有报告，但在20世纪90年代，除了撒丁岛（非洲猪瘟在1978年被引入撒丁岛）以外，其他国家都根除了非洲猪瘟病毒。非洲猪瘟病毒再一次在非洲之外的地区被报道，是2007年，在格鲁吉亚高加索地区，然后迅速蔓延至周边国家，并在2007年11月份传至俄罗斯。2018年8月份被引入中国后，在2019年造成约1110亿美元的损失。非洲猪瘟现在依然在整个亚洲地区肆虐，包括蒙古，越南，泰国，印尼，柬埔寨，菲律宾以及部分大洋州地区。

尽管非洲猪瘟依然肆虐，但目前为止，还没有疫苗可用，并且也没有其他有效的治疗方案，在这种情况下，目前的防控主要依赖于，快速识别，隔离以限制传播，以及扑杀感染猪群。目前对于非洲猪瘟疫苗的研发投入很多，但同时，也应该对抗病毒药物有所关注。

核苷及核苷类似物，该族化合物中的许多成员由于具有天然核苷酸相似的结构，可以竞争性地结合到生物体地DNA或RNA大分子中，干扰生物体遗传信息的复制和转录过程，从而可以对DNA或RNA病毒表现出抗病毒活性。碘甘是第一个被发现具有抗ASFV活性的核苷类似物（1965年）。在二十世纪八十年代，9-[(S)-3-羟基-2-(膦酰甲氧基)丙基] 腺嘌呤，即(S)-HPMPA以及它的胞嘧啶和鸟嘌呤类似物即，(S)-HPMPC 和 (S)- HPMPG的抗ASFV活性被评估。

染料木素，是一种ATP类似物，属于类黄酮家族，可抑制ASFV II型的拓扑异构酶并干扰病毒DNA复制。刚性双亲融合抑制剂 (RAFIs), （具有大芳环尿嘧啶的小分子化合物，属于尿嘧啶类似物，鉴于病毒感染宿主细胞时存在膜融合反应，RAFIs 被证实能够靶向作用于病毒包膜中的脂质抑制其与宿主细胞膜的融合，从而抵抗包膜病毒的感染）无论是aUY11还是 cm1UY11,均在细胞层面表现出抗病毒活性。

然而，尽管有很多化合物在体外试验上被证明，具备抗病毒活性，但这些潜在的抗非洲猪瘟病毒药物的有效性还没有在体内实验上被评估。.尽管西多福韦在体外实验上被证明，具有抑制病毒复制的能力，但也发现西多福韦在体内，具有剂量依赖性肾毒性。但是在大鼠中进行的一项持续14天的重复剂量毒性研究发现，环西多福韦 (cHPMPC)的安全边际比西多福韦(HPMPC)提高了≥13倍，因此本试验，选择环西多福韦作为备选药物，并对其抗非洲猪瘟病毒活性进行了评估。

试验利用猪骨髓细胞源性巨噬细胞，证明了环西多福韦在无细胞毒性的浓度下，对四种基因型的非洲猪瘟病毒，均表现出剂量依赖性的抗病毒活性，相比于疫苗免疫（需要考虑交叉保护效果）来讲，环西多福韦这种泛基因型的抗病毒活性可能更有优势。随后，研究者利用目前在欧亚地区流行的基因Ⅱ型毒株，格鲁吉亚2007/1，在体外实验上，评估了环西多福韦的抗病毒活性。试验中使用的环西多福韦剂量为30mg/kg，并采用了两种给药策略，两种给药策略呈现不同的结局，这也说明了在当前形式下，给药策略的重要性。

试验一采用的给药策略为，每12小时给药一次，连续3天，然后每24小时给药一次连续4天，感染后27天，试验结束。最终有33%的攻毒猪只存活下来，中位生存时间（累计生存率为50%时，对应的生存时间）为19.5天，而对照组的中位生存时间只有6天。然而，相比于目标值，这些耐过猪只的日增重表现较差（尽管这些耐过猪只的增重依然处于中等水平）这提示，如果在商业化猪场中使用环西多福韦来控制非洲猪瘟病毒，可能会导致生长性能的下降。但相比于清群，这依然是一个更好的选择。在试验一中，由于药物治疗的副作用，包括减少进食和嗜睡在内的临床体征与ASFV感染的一些早期临床体征相似，这些也可能是导致猪只被处死的原因。这可能可以解释为什么，早期终止治疗的猪只的病毒载量较低。在保持其抗病毒活性的前提下，降低其毒性，减少对猪只生存和生长性能的负面影响，将是环西多福韦作为抗ASFV小分子治疗药物进一步被开发的重点。

试验二中，采用的给药策略为每24小时给药1次，连续4天，然后每48小时给药一次，连续12天，试验显著地延迟了临床症状的出现，但试验结束后，所有的猪只均以死亡为转归。然而，与对照组相比，环西多福韦处理的猪只，其病毒血症和组织中的病毒载量显著减少。这表明，环西多福韦确实抑制了ASFV的复制，但给药策略导致，没有足够浓度的环西多福韦暴露水平来充分抑制病毒复制。

在试验一中，获得性免疫对于耐过猪只的贡献也应被考虑在内。试验一中存活的两头猪，在感染后14天，对非洲猪瘟病毒表现出抗体应答，试验结束后5天，其体内的病毒滴度依然维持在大约104。另外两头耐过猪只显示出病毒血症滴度的延迟增加和相应的抗体反应延迟。这或许说明，在耐过猪只中，有足够的环西多福韦暴露浓度来限制病毒复制，并诱导机体产生强大的免疫反应，使得机体在停止药物治疗，并且体内的环西多福韦已经被代谢掉时，依然能够控制感染。

研究者进一步研究了其潜在的作用机制，并提出环西多福韦作为一种核苷类似物，可以抑制ASFV复制的晚期阶段。非洲猪瘟病毒的转录受时间调控，可以分为“早期”和“晚期”。中间基因和晚期基因的表达依赖于DNA复制，后者在感染后12-16小时达到峰值。研究人员对感染后4、8、18小时的基因表达水平进行分析，以确定环西多福韦的作用靶点。结果发现，与晚期基因B646L不同的是，早期基因CP312R、I73R和CP204L在感染后8小时没有显著降低，这可能是由于在8小时这个时间点，早期转录的持续存在可能掩盖了实际发生的抑制，而B646L在复制的后期才开始高表达。虽然感染4小时后，早期基因(CP312R、I73R和CP204L)的转录显著降低，但这在蛋白水平上或者BOT1/99毒株感染的细胞上，没有反映出来。这可能反映了基因型之间的微小差异，造成不同基因型之间差异的原因目前还不清楚。

通过共聚焦显微镜和流式细胞术进一步分析蛋白VP72与VP30的表达，证实cHPMPC对晚期蛋白表达有更大的抑制作用。通过在感染的不同时间点添加环西多福韦发现，当细胞在感染9小时之后再接受治疗时，其环西多福韦的抑制活性丧失，这表明环西多福韦针对ASFV复制的后期阶段。

最后，抗病毒药物开发面临的一个共同挑战是可能出现逃逸突变体，尽管逃逸突变体在RNA病毒中比DNA病毒更大的威胁。因此，研究人员在次最佳浓度下的环西多福韦条件下，对格鲁吉亚 2007/1毒株连续传代，并对基因组进行测序，结果发现，一些与病毒结构蛋白，DNA聚合酶以及DNA连接酶相关的单核苷酸位点变异。然而，通过分析与DNA复制相关的基因中的这些变异位点对其功能的影响，发现这些位点变异呈现中性效应。

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