哈尔滨兽医研究所步志高团队发现TMEM239在非洲猪瘟病毒进入早期内体中的关键作用

　　哈尔滨兽医研究所的步志高团队通过一项重要研究，揭示了非洲猪瘟病毒（ASFV）感染过程中一个关键宿主因子——TMEM239的作用机制。该研究利用了CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了一个全基因组筛选平台，从而系统性地鉴定了与ASFV复制相关的宿主因子。以下为研究的主要发现。
　　研究团队首先在WSL细胞中建立了全基因组CRISPR/Cas9筛选系统，通过将Cas9表达载体整合到细胞基因组的Rosa26位点，创建了一个稳定表达Cas9的WSL细胞系（WSL-Cas9）。随后，研究人员设计并合成了针对20,580个猪基因的186,510个特定的sgRNAs，构建了一个CRISPR筛选sgRNA质粒库。深度测序验证了该库的sgRNA含量覆盖率达到97.44%，并通过洛伦兹曲线分析显示了高度的同质性。
　　进一步的研究显示，敲除WSL细胞中的TMEM239基因显著抑制了ASFV的复制。与对照组细胞相比，TMEM239缺失的细胞中病毒DNA拷贝数和荧光强度显著降低。通过多步病毒生长曲线分析，TMEM239-/-细胞中的病毒复制水平持续低于WSL细胞，这表明TMEM239对病毒的早期复制阶段至关重要。这些发现证实了TMEM239是ASFV复制过程中的一个关键宿主因子。
　　实验结果显示，TMEM239并不参与ASFV的吸附过程。在对WSL细胞和TMEM239基因敲除细胞进行的病毒吸附实验中，两种细胞类型在病毒DNA拷贝数和病毒p54蛋白量上没有显著差异。进一步的内吞实验表明，敲除TMEM239并不影响病毒的内吞效率，这通过病毒DNA拷贝数和p54蛋白量的量化来证实。
　　研究还发现，TMEM239基因敲除显著影响了病毒工厂的形成，这是ASFV复制和组装的关键场所。在感染后18小时，与野生型细胞相比，TMEM239-/-细胞中病毒衣壳蛋白p72的荧光信号显著减弱，表明病毒的形成受阻。此外，TMEM239-/-细胞中ASFV的早期基因CP204L（编码p30蛋白）和晚期基因B646L（编码p72蛋白）的mRNA转录本水平在感染后2小时和8小时显著低于野生型细胞。
　　通过免疫共沉淀和质谱分析，研究发现TMEM239与早期内体标记物Rab5A相互作用。使用特异性抑制剂Dynasore处理的实验表明，ASFV通过clathrin介导的内吞作用（CME）进入细胞。此外，TMEM239与病毒蛋白pE248R的相互作用也被发现，这进一步暗示了TMEM239在病毒进入过程中的作用。研究还发现，在TMEM239-/-细胞中，病毒衣壳蛋白p72与Rab5A的共定位在感染后显著降低，这表明TMEM239对ASFV进入早期内体具有重要作用。
　　研究人员通过体细胞核转移技术成功生成了TMEM239基因敲除的小猪模型。对这些小猪的PBMCs进行的体外研究表明，与野生型小猪的PBMCs相比，TMEM239-/-小猪的PBMCs在感染ASFV的ad-7GD株和WT-HLJ18株后，病毒的DNA拷贝数和荧光强度显著降低。流式细胞术分析显示，在TMEM239-/-小猪的PBMCs中，主要感染细胞类型如单核细胞的比例与野生型相似，但病毒的复制受到了显著抑制。


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