核酸提取对非洲猪瘟病毒检测的影响：以鱼粉样本为例

随着非洲猪瘟（简称非瘟）和新冠肺炎疫情的先后暴发，荧光PCR检测技术得到广泛应用，诊断试剂需求呈爆发式增长，性能也有大幅度提升。养殖企业对于荧光定量PCR试剂的性能非常关注，会开展比对实验，测评选择适合自己的试剂盒，但对核酸提取试剂重视不够。很多养殖公司会采购人医领域的核酸提取试剂盒。

在新冠肺炎检测中，实验室分工明确，复杂的肺泡冲洗液、污水、粪便、环境擦拭物等样本，通常由疫控中心、海关、传染病医院等特定的检测单位在特定的场景下采集并检测。通常的新冠肺炎筛查样本相对单一且干净。为应对新冠疫情的全民筛查和快速获得结果，人医领域的磁珠自动提取方法从最开始的30～60分钟完成核酸提取缩短到目前的15分钟完成。

快速的磁珠提取法对相对“干净”的咽拭子和血液样本，提取核酸的得率和纯度影响可控；而在农牧行业，样本通常比较脏，样本类型复杂多样，对提取试剂盒的性能和适用性要求更高。人医领域的快速磁珠提取试剂盒并不能完全满足兽用检测的需求。

饲料原料是引入生物安全风险的一个因素。其中，鱼粉价格昂贵，今年上半年原料价格上涨，养殖企业为控制成本不断压价，在鱼粉中掺杂其他成分的情况比较常见。当鱼粉中添加猪血粉或者肉骨粉时，除了带来饲料转化率的下降，也会带来非洲猪瘟病毒（ASFV）等生物安全风险。今年在多个规模养殖企业采购的饲料原料中（特别是鱼粉）检测到了高浓度的猪源性成分，也有检出ASFV核酸的案例。

2022年6月，某养殖公司发现饲料原料出现ASFV核酸污染，通过进一步排查，发现污染来源是鱼粉，该公司采集多份鱼粉样本外送多个实验室进行复测，发现检测结果差异非常明显，Ct值差异大，个别实验室甚至出现阴性结果。通过后续的调查发现，采用不同的提取试剂，是导致检测结果差异的主要因素。

01样本

选取2批此前发现掺杂了猪血粉导致ASFV核酸污染的问题鱼粉，分别在每份问题鱼粉中选取3个点进行抽样，合计为6份样本，编号标记为1-1、1-2、1-3、2-1、2-2和2-3。

02不同核酸提取试剂的评估

选择GM柱提取试剂盒、市售的其他4种柱式提取试剂、GM磁珠法提取试剂盒和市售的其他4种磁珠法提取试剂盒，共计10种核酸提取试剂盒对鱼粉样本进行核酸提取并评估。

使用同一品牌、同一批次带有猪特异性看家基因为内参照的非瘟荧光定量PCR扩增试剂盒进行扩增。

检测荧光PCR仪为上海宏石医疗信息科技有限公司的SLAN48P荧光PCR仪。

03不同柱提法提取试剂检测结果存在一定差异

6份样本，用不同柱提取试剂盒进行提取，检测获得的非洲猪瘟病毒ASFV核酸检测Ct值（FAM通道，ASFV）和猪看家基因内参Ct值（HEX通道，猪源内参）。

用GM柱提取和市售柱提取1、2、3、4共5种柱提取试剂盒，分别提取1号和2号鱼粉核酸，然后检测ASFV核酸，1号鱼粉平均Ct值分别为31.44、32.25、33.74、33.28和31.82，CV值分别为0.90%、2.56%、3.59%、2.11%和2.79%；2号鱼粉平均Ct值分别为31.90、32.19、33.01、32.52和31.86，CV值分别为1.30%、2.05%、3.35%、3.86%和2.26%（表1、图1）。

表1 不同柱提取试剂检测鱼粉样本中ASFV核酸结果

注：蓝色扩增曲线是ASFV（FAM通道），绿色扩增曲线是猪源性成分（HEX通道）

其中CV最小的为GM柱提取，GM柱提取和柱提取4检测Ct值更为靠前（图2）。

GM柱提取（Ct平均值31.44）与柱提取2（Ct平均值33.74）检测1号鱼粉Ct值平均值相差2.3，2号鱼粉Ct值平均值相差1.11（GM柱提取Ct平均值31.90，柱提取2的Ct平均值33.01） （表1、图2）。柱提取2 Ct值靠后且CV偏大。

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