如何正确诊断现代规模化奶牛场群体病毒病原体？

一、 导言

近年来，我国牛群遭受多种危害性极大病毒侵袭几乎已呈常态化，除原就施虐的口蹄疫病毒外，当下最常见的就是牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛传染性皮肤结节病毒、哺乳犊牛腹泻冠状病毒、哺乳犊牛腹泻轮状病毒、造成乳头和乳腺皮肤损伤的各种乳头瘤病毒和疱疹病毒等等。准确及时诊断这些病毒是有效防治这些病原体疾病的先决条件。本文简介如何正确诊断现代规模化奶牛场群体病毒病原体的各种方法及其优越性和不足处。

病毒是利用宿主进行复制的专性寄生体。因此，与细菌等其它微生物不同，病毒依赖于宿主细胞来生存。病毒宿主包括植物、动物、细菌和古细菌。就奶牛群体健康而言，病毒在不同类型传染病综合症（包括呼吸道、肠道、神经系统和泌尿生殖系统感染）发病机制中举足轻重，发挥着至关重要作用；此外，一些属于逆转录病毒科（Retroviridae）、乳头瘤病毒科（Papillomaviridae）、疱疹病毒科（Herpesviridae）和腺病毒科（Adenoviridae）家族的病毒还能造成奶牛群体健康其它问题，如我们常见的牛乳头瘤病毒感染造成六种不同类型乳头损伤病变。

诊断病毒性传染病需要考虑多个因素，包括临床表现、宏观病变、显微镜下病变以及实验室抗原和/或抗体检测。实验室诊断只是最终确诊组成部分之一，检测结果阴性并不意味着可排除感染特定病原体可能性。患牛选择、样本选择、采样时间、样本质量、检测方法选择和实验室处理都可能成为影响检测结果重要因素。动物病毒实验室检测通常分为两类：仍持续性感染病毒检测（活动性感染病毒检测）和先前感染过病毒检测，参阅见图1。

用于检测持续感染病毒检测包括病毒分离（VI）、电子显微镜检测（EM）、抗原酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫层析试验（ICA）、直接荧光抗体试验（DFA）和聚合酶链反应（PCR）。用于检测先前感染病毒测定包括抗体ELISA、间接荧光抗体试验（IFA）、琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）和血清中和（SN），参阅图1。对于具有血凝特性病毒，也可进行血凝素抑制（HI）血清学试验。

二、 应采集什么样本？

常用于临床病毒检测不同类型样本参阅表1。可使用羽绒型、泡沫、涤纶短纤（例如，达克龙）和人造丝细尖拭子采集样本。通常，羽绒型拭子要优于非羽绒型拭子。应避免使用藻酸钙拭子和带木柄拭子采集样本，因其可能会干扰病毒检测结果。拭子采样后应置入脑心浸液或盐溶液（如磷酸盐缓冲盐水）等病毒运输介质中。这些样本类型中，口腔液常用于猪病毒性疾病检测，因为采集操作简便易行，且口腔液可用于评估猪群群体或亚群体水平状况。可用耳组织取样器采集新鲜耳组织，通常借助抗原ELISA检测或混合样PCR检测，来揭发牛病毒性腹泻病毒（BVDV）持续感染牛（永久带毒牛=PI牛），采集的新鲜样本用冰袋打包，隔夜快递送达诊断实验室。

三、 活动性感染病毒如何检测？

检测活动性感染病毒方法具有较低（VI，EM）和较高（抗原检测和PCR）特异性，其检测病毒灵敏度从低到高依次是EM、VI、抗原检测和PCR，参阅图2。检测结果阴性并不排除动物感染目标病毒可能性。造成检测假阴性结果原因包括样本质量低、样本类型不理想、样本采集时间不当（错过了检测活动性感染病毒窗口期时间，太早或太晚）、所用检测方法灵敏度低、和/或使用特异性太高检测方法（由于目标序列变异，新变种遗漏）。

1.病毒分离（VI）

病毒分离20世纪80年代和90年代常用于病毒检测，现在仍在继续使用，但主要用于自体疫苗生产和研究目的。每逢新病毒出现时，病毒分离往往是最关键的第一步，用以判断是否与正发生的疾病真正相关。细胞培养、鸡胚甚至动物都可以用于病毒分离，但细胞培养是最常用方法。病毒分离是一种依赖细胞系的测定方法。有些病毒只能在单一类型细胞系中生长，而另一些病毒可以在多种细胞系中复制，参阅表2。病毒分离工作耗力费时，有时需要多次传代才能清晰地看到细胞病变效应（Cytopathic Effect=CPE）。除了观察细胞病变效应外，还需要进行如DFA、EM和PCR等额外检测来确认特定的病毒分离是否成功。有一个实例可以说明：分离牛轮状病毒期间，在MA-104细胞中观察到细胞病变效应，尽管通过PCR未能检测到轮状病毒，但进一步电子显微镜检视揭示了病毒样颗粒存在，再经下一代测序证实为牛小核糖病毒（Bovine Parechovirus）。就BVDV病毒分离工作而言，通常使用添加了马血清而非胎犊血清（FBS）的细胞培养进行，因为胎犊血清可能含有BVDV。由于BVDV存在两种生物型：细胞病变型（Cytopathic=CP）和非细胞病变型（Noncytopathic=NCP），故BVDV病毒分离结果应始终通过DFA或PCR进行确认，以捕获那些非细胞病变型株。大多数病毒可通过细胞培养分离，但某些家族病毒，如杯状病毒科（Caliciviridae）家族的诺如病毒，却难以分离。对于猪繁殖和呼吸综合症病毒（PRRSV），通常使用MARC-145细胞系进行病毒分离，但分离成功率远低于ZMAC细胞系，后者来源于猪胎儿肺灌洗液样本。ZMAC细胞表达典型的巨噬细胞标志物。推测PRRSV病毒与宿主细胞之间可能相互作用导致这两种细胞系在该病毒分离成功率差异明显。为提高病毒分离效率，还开发了表达犬SLAM（CD150）受体的vero细胞，（非洲绿猴肾细胞，是一种异倍体细胞，经猕猴肾细胞培养衍化后产生的，和著名的Hela细胞系、犬肾细胞即MDCK细胞一样是常用的细胞系）用于犬瘟热病毒分离。此外，通过向细胞培养中添加胰蛋白酶，也可提高某些病毒如冠状病毒分离效率。分离猪萨波病毒等病毒则需要胆汁酸。如果病例中存在不同病毒或同一病毒不同基因型的共同感染，病毒分离可能会获得两种病毒分离物或仅获得优势病毒分离物，这时需要分别纯化来分离它们。如两种类型PRRSV共同感染，ZMAC细胞系能够分离出这两种类型病毒，而MARC-145细胞系则只能分离出一种类型病毒。总之，病毒分离对某些诊断目的如新病毒发现具有重要用途；然而，上述注意事项用于常规检测目的时可能出现假阴性结果。

2.电子显微镜检测（EM）

^{基于病毒大小、形状、衣壳外观、是否有包膜以及表面突起，电子显微镜检测通常能够使用负染色技术将病毒识别到科或属水平。临床上，电子显微镜检测轮状病毒、冠状病毒、痘病毒和副痘病毒比其它类型病毒更敏感。电子显微镜检测通常要求样本中含有大量病毒颗粒（≥105颗粒/毫升），这突显了其低灵敏度缺点，且结果具有主观性。由于这些缺点以及耗时费钱，常规诊断中较少使用电子显微镜检测。不过，电子显微镜检测在新病毒发现中依然有一定价值，特别对那些常规方法检测结果为阴性的样本而言。前述牛腹泻病例中鉴定出牛小核糖病毒和猪中发现猪δ冠状病毒就是使用电子显微镜检测发现病毒的极好佐证。}

3.病毒抗原检测

兽医诊断实验室中使用的三种不同抗原检测方法，分别是抗原ELISA、ICA和DFA。一些实验室可提供针对禽流感病毒、猫白血病病毒和BVDV的抗原ELISA。抗原ELISA方法灵敏度通常低于PCR，参见图2。BVDV抗原ELISA可通过耳组织样本来鉴定持续感染牛（PI牛），但使用血液或血清样本进行BVDV抗原ELISA检测可能因哺乳犊牛存在母源抗体干扰而欠准确。因此，3月龄以下犊牛不建议使用血清样本做BVDV抗原ELISA检测。ICA是一种快速检测病毒抗原的即时检测方法。我国杭州爱谨公司开发生产的犊牛腹泻五联抗原检测试纸卡，可现场即时检测轮状病毒、冠状病毒、隐孢子虫、产气荚膜梭菌和大肠杆菌K99。该公司生产的另一款牛病毒性腹泻抗原检测试纸卡，则可现场即时检测牛病毒性腹泻病毒。抗原ELISA结果基于光密度（OD）值，而ICA结果则基于特定条带可视化。DFA常用于实验室中检测组织和血液样本中病毒抗原，并主要用于尸检病例。由于其结果主观性和较低灵敏度，DFA正逐渐被分子学检测方法替代。但对于脑组织中狂犬病病毒检测，DFA仍然是黄金标准检测方法。

4.聚合酶链反应（PCR）

PCR用于检测DNA和RNA病毒的病毒基因组。与DNA病毒不同，RNA病毒在PCR扩增前需要一个额外的逆转录（RT）步骤。常规PCR或实时PCR均可用来检测病毒样本。常规PCR需要结果可视化（如凝胶电泳），而实时PCR产生一个循环阈值（Cycle Threshold=CT），该值与样本中病毒基因组数量成反比。循环阈值高表明病毒载量低，这可能表明潜伏期不足或处于恢复期、样本类型不理想，或引物和探针序列与新变体之间不匹配等。一般来说，PCR阳性结果不能区分感染动物和疫苗免疫接种动物，因为接种改良活病毒疫苗（弱毒疫苗）动物并不总是产生高循环阈值，检测出病毒基因组量也可因疫苗接种途径而异。如活化改良疫苗株基因组中包含标记物，就可通过PCR区分接种疫苗动物和野外型感染（野毒感染）动物。

由于实时PCR具有更高灵敏度，常对疑似感染某些病毒的临床异常动物采用混合样本进行实时PCR检测，如耳组织混合样本或血清BVDV混合样本、血清PRRSV混合样本和禽流感病毒拭子混合样本等。常规PCR或实时PCR检测不仅针对单一病毒单一基因组目标，而且通常还会检测单一或多个病毒两个或更多目标，称为差异检测。双重实时PCR检测PRRSV北美和欧洲基因型、猪圆环病毒2型和3型、马疱疹病毒1型和4型，以及BVDV1型和BVDV2型。在单一样本中，新近开发的特定综合多重PCR组套可同时检测四种牛呼吸道病毒病原体：牛疱疹病毒1型+牛病毒性腹泻病毒（BVDV）+牛副流感病毒3型和牛呼吸道合胞病毒；也可同时检测五种牛肠道病原体：牛冠状病毒+牛轮状病毒A型+隐孢子虫+产气荚膜梭菌和大肠杆菌K99。

因为实时PCR和常规PCR只针对病毒部分基因组，两者都不能提供关于剩余区域是否有变化信息，故需要进行额外检测，如亚型PCR或测序，藉以进一步分析病毒特征。还由于其较高灵敏度，所以并非所有阳性样本（特别是阳性极弱样本）都适合借助其它灵敏度较低方法如测序和病毒分离做进一步特征分析。根据病毒类型、样本类型和使用测序方法，进行全基因组或单一基因测序阳性样本循环阈值会有所不同，目前认可≤31。对于那些循环阈值高而不适合进行测序样本，可通过其它方法分析其特征，包括免疫组织化学。第一个例子是在美国识别出一种重组猪繁殖与呼吸综合症病毒株，该株在5'端有约7000个核苷酸，其余基因组与野生型和Fostera疫苗株高度相关。对一个猪场两个样本进行PRRSV实时RT-PCR检测，发现存在北美基因型。ORF5测序在两个样本中分别识别出一种疫苗株和一种野生型株，但针对非结构蛋白2区域的疫苗特异性实时RT-PCR在两个样本中均为阴性。除了野生型株外，全基因组测序还确认了疫苗株与野生型株之间存在一种新的重组株。第二个例子是在美国识别出变异型猪流行性腹泻病毒（PEDV）。这种变异株刺突基因中有重大变化，而这些变化实时RT-PCR中并未检测到，因为检测目标基因是核衣壳基因。临床观察到仔猪症状减弱促使进一步使用全基因组测序对该株进行特征分析，结果识别出的变异型PEDV株OH851中观察到刺突基因的3个缺失、1个插入和若干点突变。最后一个例子是在美国识别出麻雀δ冠状病毒。由于麻雀和猪δ冠状病毒在非刺突区域（如ORF1ab和核衣壳基因）中具有高度基因相似性，设计用于检测猪δ冠状病毒的实时RT-PCR也可以检测到麻雀δ冠状病毒。野鸟可自由进出的环状猪舍中，麻雀带有麻雀δ冠状病毒的粪便可能会污染猪样本，导致从临床健康猪采集的样本中出现猪δ冠状病毒假阳性结果。因此，必须进行全基因组测序以揭示每个特定毒株并识别任何变化（缺失、插入、点突变、重组）。

与上述不同猪和鸟类中δ冠状病毒类似，牛样冠状病毒也存在于各种动物物种中，包括家养和野生反刍动物，甚至是非反刍动物，这可能会在与其它动物混养奶牛场使检测牛冠状病毒复杂化。此外，尚未发现导致牛呼吸道或肠道疾病的冠状病毒遗传标记物。新兴病毒识别通常涉及使用泛PCR加测序（如在中国发现牛Hobi 样瘟病毒）或直接宏基因组测序（如牛小核糖病毒鉴定例子）等检测手段。鉴于畜牧业生产中总会出现新病毒和病毒株，这些新方法将有助于迅速准确破解不明原因的疑似病毒性疾病爆发的真正元凶。

四、血清学反应检测病毒

疾病急性期和恢复期采集的配对血清样本可用来确定奶牛活动性病毒感染。通常，测试单一血清样本可预测以前是否接触过任何病毒或接种疫苗后对病毒的免疫状态。常用血清学反应检测方法：ELISA、IFA、AGID、SN和HI。一般来说，血清学检测阳性结果并不能区分免疫接种后母体抗体或野毒感染后产生的抗体，也不能区分奶牛是否做过免疫接种或感染过野毒。

1.抗体酶联免疫吸附试验（ELISA）

由于出结果快和灵敏度高，ELISA常用于检测许多病毒抗体。可使用间接抗体ELISA或竞争性ELISA（cELISA）。ELISA主要用于筛查检测，某些情况下，检测结果需要通过具有更高特异性检测方法进一步确认。例如，PRRSV抗体ELISA阳性血清样本需要再通过IFA测定来确认。此外，马传染性贫血病毒ELISA阳性结果也需通过AGID进行确认。对于国家管控疾病的疫苗接种免疫动物，血清学检测应能够区分野毒感染动物和接种疫苗动物。实证之一是：曾成功开发出一款猪伪狂犬病病毒（PRV）基因删除（gI/gE）的“标记”疫苗。因此，ELISA gI抗体检测可用来确定猪群是否感染过猪伪狂犬病病毒野毒或注射过含有gI抗原的猪伪狂犬病病毒疫苗，而ELISA gB抗体检测可结合ELISA gI抗体检测一起用来评估猪群注射疫苗免疫状态或感染猪伪狂犬病病毒现状。间接抗体ELISA结果直接使用OD值评估，或根据OD值计算样本与阳性比率，而cELISA结果则计算使用样本和阴性对照的OD值抑制百分比。

2.间接荧光抗体测试（IFA）

与能够扩大检测规模的ELISA相比，IFA较为繁琐且灵敏度较低，因此较少使用。IFA可检测猫传染性腹膜炎病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus=PEDV）、传染性胃肠炎病毒和PRRSV。检测结果依赖于荧光显微镜观察的荧光信号，故结果解释具有主观性。通过样本连续稀释，IFA可用来半定量检测样本IFA滴度。

3.琼脂凝胶免疫扩散（AGID）

琼脂凝胶免疫扩散是最常用血清学检测方法之一，用于如禽流感病毒、流行性出血病病毒和出血性肠炎病毒等病毒检测。琼脂凝胶免疫扩散检测结果基于观察抗原和特异性抗体之间在设置检测后24至48小时之间形成的沉淀线。因为琼脂凝胶免疫扩散特异性高于ELISA，故其通常用作某些病毒ELISA检测结果的再确认检测，例如马传染性贫血病毒。

4.血清中和（SN）

血清中和有时也称病毒中和或抗体中和，同样是血清学检测方法之一，用于检测感染后或接种疫苗后血清样本中存在的中和抗体滴度。常规血清中和检测基于在细胞培养中通过中和抗体抑制病毒感染性，并观察有无细胞病变效应结果做出判断。血清中和检测滴度计算为血清样本产生无细胞病变效应最高稀释度的倒数。评估免疫状态时，血清中和检测滴度通常与机体本身保护机理相关。某些情况下，如长途运输动物时，需要进行血清中和检测，如水泡性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus）。血清中和检测技术要求高，费力且耗时；检测结果解释依赖于疫苗接种历史、采样时间点和疾病史等信息。接种灭活疫苗牛的血清中和检测滴度相对较低，而未接种疫苗牛与接种活疫苗（弱毒）牛相比，野毒感染牛具有相对相似或更高滴度。此外，对于需要生物安全等级3（Biosafety Level 3=BSL 3）的病毒，只有生物安全等级2（BSL 2）设施的实验室将无法进行血清中和检测。除了常规血清中和检测外，还有基于阻断病毒受体和蛋白互作的伪病毒血清中和检测或替代病毒血清中和检测可用。

5.血凝抑制（HI）

血凝抑制检测方法通常用于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）、副粘病毒科（Paramyxoviridae）、细小病毒科（Parvoviridae）和腺病毒科（Adenoviridae）家族等病毒检测，这些病毒具有能够凝集红细胞的血凝特性。血凝抑制检测测量阻止病毒血凝素作用凝集红细胞的抗体，从而使红细胞沉积到微量滴定板底部。因此，血凝抑制检测结果基于观察板孔底部红细胞形成的“按钮”。血凝抑制检测滴度计算为血清样本产生完全抑制血凝最高稀释度的倒数。

五、 小结

实验室检测病毒是临床诊断的一部分，快速可靠检测结果提供了支持正确有效诊疗防现代规模化奶牛场群体病毒疾病重要依据。检测活动性感染病毒和血清学病毒反应是两种互补的病毒诊断方法，缘于检测活动性感染病毒窗口期时间比检测血清学病毒反应窗口期时间短得多。过去几十年，临床病毒检测业已从传统病毒分离检测和电子显微镜检测转向分子PCR和即时抗原检测。这种诊断方法的转变也意味着从寻找感染性病毒粒子转向狩猎病毒抗原和基因组。与此同时，病毒血清学检测继续从检测具有较低灵敏度的抗体方法发展到具有更高灵敏度和特异性方法。这些变化还允许兽医诊断实验室进行高通量测试。随着科技不断发展和完善，预计未来宏基因组测序将普遍应用于兽医临床诊断，藉以客观准确揭示疾病微生物全貌。

就本文内容而言，同道们需理解和牢记以下要点：

1.临床病毒检测结果受多重因素影响，包括采样时间、样本类型、样本质量和检测方法。

2.活动性感染病毒检测窗口时间比先前已遭病毒感染检测窗口时间短。

3.低病毒载量可能表明奶牛处于感染早期或恢复阶段、近期接种了减毒活疫苗，或样本来自病毒非最佳复制部位。

4.检测结果阴性并不排除奶牛感染可疑病毒可能性。

▍本文来源：荷斯坦杂志

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