ASFV可通过多种途径传播,包括口腔摄入、气溶胶接触、先天性传播、通过精液传播以及通过软蜱(生物储库)传播。受感染的猪通过分泌物和排泄物(包括口腔和鼻液、血液、粪便和尿液)将病毒释放到周围环境中。鼻对鼻直接接触或吸入气溶胶中的病毒会增加病毒传播的风险。研究表明,经鼻内接种的猪会患上急性疾病,并可在猪的鼻拭子中检测到病毒。在空气接触猪的鼻拭子中可检测到病毒。这表明传染性ASFV颗粒存在于鼻粘膜中。然而,ASFV在鼻粘膜中的致病机理尚不清楚,粘膜中的ASFV发病机制仍然未知。本研究采用鼻腔外植体模型,探讨了鼻黏膜在ASFV感染中的作用。

鼻黏膜是病原体进入呼吸系统的第一道屏障。最外层是假增生的纤毛柱状上皮,其完整性和极性由细胞间连接(ICJ)精心维持。下面是固有层,这是一层疏松的结缔组织层,上面布满了腺体和免疫细胞。粘膜下层与固有层相似,但比固有层更致密,位于更深的一层。鼻腔气道的上皮细胞通常是病毒的首要目标,其次是上皮和固有层中的免疫细胞。这些受感染的免疫细胞会让病毒穿透上皮屏障,穿过固有层,最终进入血液。

在这项研究中,使用了一种模拟体内条件的呼吸道粘膜外植体模型,使用基因I型毒株E70和基因II型毒株Belgium2018/1(BEL18)来探索ASFV在鼻粘膜中的感染模式。此外,我们在Transwell上分离和培养了原代猪呼吸上皮细胞(PoRECs),以检查ASFV结合和随后病毒复制的极性。

研究结论

1、鼻黏膜三个不同区域(上皮细胞层、固有层和粘膜下层)的感染细胞的分析表明,无论病毒株如何,固有层都是ASFV复制的优先位点。非洲猪瘟病毒可能利用不同类型的细胞进入呼吸道黏膜进行复制。

2、两种非洲猪瘟病毒基因型的感染机制不同,基因型I偏爱基底侧表面,而基因型II则偏爱顶端表面。

数据分析

用不同基因型ASFV和选定的细胞标志物进行了双IF染色,并计算了上皮、固有层和粘膜下层感染细胞中细胞标志物阳性细胞的比例。

鼻外植体中ASFV感染细胞的鉴定。

A在72hpi对鼻中隔(顶部)和鼻甲(底部)外植体进行ASFVp72(绿色)与CD163(红色)组合的双IF染色。细胞核染色呈蓝色。黄色虚线表示一组感染。白色虚线表示粘膜上皮(EP)和固有层(LP)之间的边界。ASFV+CD163+细胞和ASFV+CCD163-细胞分别用白色箭头和黄色箭头表示。比例尺:50μm。B鼻外植体中ASFV感染的动力学研究。在0、24、48和72hpi的截面中,感染细胞的总数以mm2面积表示。通过双向方差分析和Tukey的多重比较事后检验来确定统计显著性。不同的字母表示时间点之间的显著差异(p<0.05)。所有数据均以三只动物的平均值±标准差(SD)表示。C通过鼻外植体中的区域的ASFV感染细胞的百分比。在鼻组织类型和基因型中,大多数感染细胞都位于固有层。EP:上皮,LP:固有层,SM:粘膜下层。

图片

A4I-E70基因型和II-BEL基因型毒株在呼吸道上皮细胞中的差异嗜性。

E70(左)和BEL18(右)毒株在呼吸道上皮细胞中的体外感染。通过顶部、基底外侧或EGTA处理后的顶部接种细胞。在24、48和72hpi时对ASFV感染的细胞进行计数。使用双向方差分析和Tukey的多重比较事后检验分析统计学显著性。不同的字母表示不同时间点之间的显著差异(p<0.05)。数据显示为三个独立实验的平均值±SD.B感染ASFV的PoRECs的代表性IF图片。对ASFVp72(绿色)、细胞角蛋白(红色)和细胞核(蓝色)进行免疫荧光染色。图片显示呼吸道上皮细胞中E70的基底外侧感染(顶部)和BEL18的顶端侧感染(底部)持续感染72小时。使用20倍或63倍物镜拍摄图像。箭头表示受感染的细胞。在以63倍放大倍数拍摄的图像中,白色箭头表示细胞角蛋白+感染的细胞,而黄色箭头指向细胞角蛋白-感染的细胞。比例尺:50μm。

原文:Differential infection behavior of African swine fever virus (ASFV) genotype I and II in the upper respiratory tract


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